Analyses œnologiques & agroalimentaires

La Méthoxy Diméthylpyrazine (MDMP)

Origine et Incidence de la 2-Méthoxy-3,5-Diméthylpyrazine (MDMP), composé à l’arôme « moisi » et « liégeux », détectable dans les bouchons en liège et les copeaux de bois de chêne placé au contact des Vins

Figure 1- 2-méthoxy-3,5-diméthylpyrazine (MDMP)

Figure 1- 2-méthoxy-3,5-diméthylpyrazine (MDMP)

Introduction  Parmi les altérations les plus communes et les plus désagréables, le « goût de bouchon », qui correspond le plus souvent à une odeur à caractère « moisi », est principalement causée par le 2,4,6-trichloroanisole (TCA) (1,2). Cependant, on ne peut pas considérer qu’il existe une seule et unique molécule à l’origine des défauts communiqués par le liège aux vins en bouteille. D’autres molécules ont été identifiées dans les bouchons et peuvent causer, à moindre titre que le TCA, des altérations complémentaires (3). Ces composés incluent en particulier la géosmine à l’odeur « terreuse », la 3-octènone avec une odeur de « champignon » et également la 2-méthoxy-3,5-diméthylpyrazine (MDMP) (figure 1) qui communique un arôme plus complexe évoquant à la fois le « liège humide » (caractère « liégeux »), la « noisette fraîche » (caractère « végétal ») et jusqu’à une odeur franchement « moisie » ou « terreuse » (pomme de terre) lorsque la concentration est élevée. La MDMP a été clairement isolée et identifiée dans le liège par Simpson et al. (4) en Australie, mais elle a été caractérisée la première fois par Mottram et al. (5) en Angleterre dans un environnement très différent. Ces auteurs ont détecté la présence de MDMP dans des émulsions liquides servant à la lubrification d’outils de coupe ; ils ont isolé une souche bactérienne aérobie à l’origine de la formation de cette substance volatile et odorante sans être alors capable de l’identifier. Dans le cas du vin, le seuil de perception (ou de recouvrement plus exactement) de la MDMP a été estimé à 2.1 ng/L (4). Cette molécule a été également identifiée dans le café (6) et semble pouvoir contribuer à l’arôme, positif ou négatif, d’un plus grand nombre de produits alimentaires. En effet, les alkyl et les alkoxypyrazines sont des molécules aromatiques importantes et largement répandues dans la nature. Un assez grand nombre d’organismes est capable de synthétiser des alkylméthoxypyrazines proches de la MDMP, notamment des bactéries (7,8,9,10), mais aussi des insectes (11), ou des végétaux (12,13) et même Vitis vinifera (14). Cai et al. (15) ont également identifié un isomère de la MDMP qui nous intéresse dans ce travail, la 3-methoxy-2,5-diméthylpyrazine, chez la coccinelle Harmonia axyridis (multicolored asian lady beetle).

Dans ce travail, nous rapportons d’abord l’identification précise du micro-organisme l’origine de l’identification de la MDMP isolé par Mottram et al. (5) et qui était jusque-là inconnu. Nous étudions ensuite les voies métaboliques de la biosynthèse de la MDMP par ce micro-organisme. Enfin, à travers des cas concrets rencontrés dans l’industrie vinicole, nous rapportons des situations de contamination du vin par des bouchons en liège contaminés par de la MDMP ; mais également par du bois de chêne placé au contact du vin. Les données présentées permettent d’évaluer différemment les risques associés à cette molécule dans l’industrie vinicole.

Identification de la bactérie à l’origine de la synthèse de la MDMP

Rhizobium excellensis 2a

Figure 2a – Rhizobium excellensis en microscopie électronique à balyage

La souche bactérienne capable de bio synthétiser de la MDMP isolée par Mottram et al. (5) et déposée au National Collection of Industrial Bacteria sous le N° 118020  possède une morphologie de coques (1,1×1,2-2 µm) solitaires ou par paires, non mobiles, Gram négatifs. Les figures 2 a) et 2 b) présentent l’aspect en microscopie électronique à balayage des cellules bactériennes en question et d’une sécrétion exo cellulaire tendant à les amalgamer. La bactérie réagit négativement au test de l’oxydase et positivement au test de la catalase. L’analyse de la composition en acide gras et sa comparaison aux profils de référence ne permet pas une identification directe. La meilleure comparaison est obtenue avec Phyllobacterium rubiacearum mais avec un indice de correspondance trop faible. La comparaison avec les bases de données de référence permet de classer a priori la culture parmi le genre Rhizopium sp.

 

Rhizobium excellensis 2b

Figure 2b – Rhizobium excellensis en microscopie électronique à balyage

L’analyse génétique par séquençage partiel du 16S rDNA ne permet pas non plus d’obtenir immédiatement une identification de l’espèce par comparaison aux profils disponibles ce qui démontre que l’isolat bactérien en question appartient à une nouvelle espèce. La similarité de séquence la plus élevée est trouvée parmi plusieurs membres de la famille des Bradyrhizobiaceae (Afipia, Bosea, Bradyrhizobium, Nitrobacter et Rhodopseudomonas) et des Methylobactoriaceae (Methylbacterium) de l’ordre des Rhizobiales. Pour autant, sur la base unique de cette analyse phyllogénétique, il n’est pas possible de conclure exactement à quel genre ou à quelle famille la souche isolée s’apparente exactement ; il s’agit définitivement d’une espèce jusque là non répertoriée.

Rhizobium, Agrobacterium, Allorhizobium et Sinorhizobium constituaient différents genres dans la famille des Rhizobiaceae. Sur la base des profils du 16S rDNA et de leurs phénotypes, ces différents genres ont pu être regroupés en en seul genre : Rhizobium (16). En conséquence, nous identifions dans ce travail la bactérie jusque-là inconnue à Rhizobium excellensis.

 

La biosynthèse des alkyl-méthoxyprazines dans l’environnement

Différentes bactéries sont capables de synthétiser des alkyméthoxypyrazines. Pseudomonas perolens est capable de synthétiser dans la viande de poisson la 2-isopropyl-3-méthoxypyrazine (IPMP), et à moindre titre de la 2-sec-butyl-3-méthoxypyrazine, avec le développement d’odeurs évoquant celle de la pomme de terre moisie (7). P. taetrolens a été identifié comme susceptible de former de l’IPMP dans le lait (8). Serratia sp. et Cedecea sp. sont connues pour produire ces mêmes alkyméthoxypyrazines (9). Les myxobactéries comme Chondromyces crocatus produisent un assez grand nombre d’hydroxy-alkylméthoxypyrazines ainsi que de la MDMP et son isomère 2-méthoxy-3,6-diméthyl-pyrazine (10). Prat et al. (17) indiquent que Pseudomonas fluorescens serait incapable de former du TCA mais synthétiserait de la MDMP dans le liège. Néanmoins, ces auteurs n’ont pas pu caractériser objectivement la présence de cette substance (détection par GC/olfactométrie mais pas de confirmation par GC/MS) ; ils déduisent leur conclusion des travaux de Mottram et al. (5), signalant que d’autres Pseudomonas produisent également cette molécule, ce qui n’est pas exact. En effet, d’une part les travaux cités par ces auteurs au sujet de Pseudomonas sp. sont relatifs à l’IPMP et pas à la MDMP, d’autre part la bactérie isolée par Mottram et al. (5) n’appartient pas au genre Pseudomonas mais au genre Rhizobium comme nous venons de le démontrer. A la lumière de l’étude des profils de restriction de la séquence du gène codant pour l’acide ribonucléique ribosomique (16S rDNA), beaucoup de bactéries classifiées antérieurement comme Pseudomonas n’appartiennent pas en réalité à ce genre ;  il se pourrait fort bien qu’il s’agisse de R. excellensis plutôt que de P. fluorescens.

La capacité de synthèse de plusieurs micro-organismes réputés capables de synthétiser des alklyl-méthoxypyrazines et notamment de la MDMP a été vérifiée au laboratoire (tableau 1). On constate que parmi les différentes protéobactéries étudiées, et comparativement à un deutéromycète (Penicilium glabrum) classiquement identifié sur le liège et capable de former du TCA (18), seuls Serratia odorifera, Chondromyces crocatus et Rhizobium excellensis s’avèrent capables de former de la MDMP en grande quantité en présence d’une source complexe d’acides aminés (extrait de levure). La souche de Pseudomonas fluorescens étudiée ne forme pas dans nos conditions de MDMP à une concentration détectable (limite de détection = 0,6 ng/L). A notre connaissance, la formation de MDMP par Serratia sp. n’avait pas été rapportée jusque là.

Tableau 1- Biosynthèse de la MDMP par différents types de microorganismes

IdentificationOrigine de la soucheProduction relative de MDMP
Pseudomonas perolensLMG13577/ATCC10757-
Pseudomonas fluorescensLMG5822/ATCC11251-
Serratia odoriferaLMG7885/ATC330770.082
Chondromyces crocatusDSMZ 146060.088
Rhizobium excellensisNCIMB11808/LMG24089100
Penicilium glabrum MUCL35034-

Les résultats présentés dans ce travail rapportent donc pour la première fois l’identification précise d’une bactérie du genre Rhizobium, isolée initialement d’un milieu sans rapport avec le liège ou le vin, capable de synthétiser de fortes quantités de MDMP. Ce type de micro-organisme est particulièrement commun dans le sol et pourrait parfaitement contaminer les planches de liège à un stade et dans des conditions qui restent à déterminer. Il est également possible que cette bactérie puisse contaminer les bouchons lors de leur tubage en polluant les tubeuses via éventuellement leur système de lubrification. Etant donné la forte capacité de biosynthèse de R. excellensis ce type de microorganisme pourrait représenter la source principale de MDMP identifié précédemment dans le liège.

Contamination de vins en bouteille bouchés avec des bouchons en liège par de la MDMP

Lors de la dégustation de différentes bouteilles d’un vin rouge issu d’une propriété Grand Cru Classé de l’appellation St Emilion en région bordelaise (France) du millésime 2001, un nombre important de bouteilles bouchées avec un même lot de bouchon issu d’un même fabricant a révélé un profil organoleptique très différent du reste du même vin, bouché dans les mêmes conditions et au même moment, mais avec les fournitures de trois autres bouchonniers. Si quelques bouteilles présentaient un défaut visiblement caractérisable de « goût de bouchon » en raison d’un caractère « moisi » très particulier (1 % en moyenne du lot total), le responsable de production a été beaucoup plus inquiété par l’importante proportion de bouteille (> 30%) présentant, non pas un défaut caractéristique, mais une profonde et négative modification du profil organoleptique. Compte tenu des descripteurs cités, ce défaut à caractère « liégeux » et « végétal » au nez avec un « boisé sec » en bouche, s’apparentait plus pour les dégustateurs à un manque de qualité du vin qu’à une évidente altération provenant du bouchage.

L’analyse du vin et du bouchon correspondant de quelques bouteilles bien caractéristiques donne les résultats présentés dans le tableau 2. Différents composés réputés capables de communiquer des odeurs à caractère « moisi », « bouchonné » et « poussiéreux » comme les haloanisoles (1,2,3,19) ont été dosés simultanément avec la MDMP dans les vins et dans les bouchons après macération individuelle de 72h dans une solution hydro-alcoolique modèle simulant le vin. On constate que dans ce cas particulier, le 2,4,6-tribromoanisole (TBA) n’est jamais détectable (< LOD 0.2 ng/L). Le 2,3,4,6-tétrachloroanisole (TeCA) est dosée à une concentration systématiquement identique dans tous les cas tant dans le vin que dans la macération de bouchon. Ce contaminant provient à l’évidence, comme le confirme la présence de pentachloroanisole (PCA) dans les mêmes proportions, d’une pollution environnementale du vin et du bouchon par l’ambiance de la cave (20), le liège des bouchons est étranger à là présence de ces composés. En outre, les teneurs de ces molécules sont très en deçà des seuils de détection par dégustation ; ces substances ne participent donc aucunement aux défauts notés dans le vin en cause. On dose dans certaines bouteilles des quantités de 2,4,6-trichloroanisole (TCA) qui atteignent ou dépassent le seuil de perception de ce contaminant dans le vin et qui communiquent une odeur de « moisi » et un caractère « bouchonné » bien typique à partir de 2 ng/L environ (2). Ce composé, présent très aléatoirement d’une bouteille à l’autre, provient à l’évidence des bouchons employés (figure 3). De la même manière, la MDMP mesurée dans les vins altérés entre 1.4 et 3.5 ng/L est bien corrélée à la MDMP dosable dans les macérations des bouchons correspondants (figure 4). D’après Simpson et al. (4), à la différence du TCA qui possède une forte affinité pour le tissu subéreux, la MDMP semble nettement plus facile à extraire du liège par le vin. Cette propriété pourrait peut-être expliquer une moins bonne corrélation entre la MDMP dosée dans le vin et la quantité résiduelle détectable a posteriori dans les bouchons en cause dans certains cas. En revanche, il n’existe visiblement aucune relation entre TCA et MDMP , tant dans les vins que dans les bouchons en liège (figure 4). Ceci laisse penser à des origines biochimiques totalement différentes car, si R. excellensis est bien capable de synthétiser de grandes quantités de MDMP, nous avons vérifié qu’elle ne produisait pas de TCA même en présence de TCP.

Table 2- Analyse de différentes bouteilles d’un même vin et des bouchons correspondants jugés dans certains altérées par un caractère « liégeux » ou « moisi »

BottleMDMPTCATeCAPCATBAMDMPTCATeCAPCATBADéfaut sensoriel
Bouchon ng/L/ bouchon*Bouchon ng/L/ bouchon*Bouchon ng/L/ bouchon*Bouchon ng/L/ bouchon*Bouchon ng/L/ bouchon*Vin en ng/LVin en ng/LVin en ng/LVin en ng/LVin en ng/L
Témoinndnd1.02.5ndndnd1.51.8ndnon
1nd0.91.22.5ndnd0.81.42.0nddouteux
2nd0.81.22.5ndnd0.61.62.4nddouteux
3traces0.61.22.3nd1.41.41.52.8ndprésence
4nd0.81.02.6ndnd1.61.51.8ndprésence
53.50.81.02.5nd2.91.11.62.0ndfort
6traces0.81.12.0nd3.22.91.62.5ndfort
75.11.01.02.5nd3.50.81.21.8ndfort
8nd1.71.12.7ndnd1.81.51.8ndmoisi

* Teneur en contaminants extractibles dans une macération hydro-alcoolique individuelle des bouchons

Correlation-TCA-dans-le-vin-TCA-bouchons

Figure 3- Corrélation entre TCA dosable dans le vin et le TCA extractible mesuré dans les bouchons correspondants

Correlation-MDMP-vin-et-MDMP-bouchons

Figure 4- Corrélation entre la MDMP dosable dans le vin et MDMP extractible mesurée dans les bouchons correspondants

Teneurs en MDMP de différents lots de bouchons en liège naturels

Nous avons analysé la teneur en MDMP totale, c’est-à-dire obtenue à partir d’un extrait au dichlorométhane de liège finement broyé, de plusieurs lots de bouchons neufs en liège naturel (49 x 24 mm, premier choix visuel) avant leur utilisation ; ces lots provenaient de différents bouchonniers (au nombre de 5, tous originaires du Portugal), et ont été offerts à une même propriété durant 36 mois (43 lots cumulant un peu moins de 500 000 bouchons).

On constate que la MDMP est dosable (> 2.0 ng/cork) (figure 5) dans une grande majorité des lots de bouchons (86%). A ce stade on ne connait pas la relation existant entre la MDMP mesurable dans un extrait organique de bouchons broyés et ce qui serait susceptible de migrer réellement dans la situation d’un vin bouché. On peut penser que les bouchons contenant jusqu’à 5.0 ng/bouchon au plus représentent un risque de contamination faible ou nul et cumulent 24.9 % des lots. Les lots contenant entre 5.1 et 15.0 ng/bouchon de MDMP représentent certainement un risque plus sérieux de pollution du vin en bouteille et atteignent 51,2 % des lots, tandis que les lots fortement contaminés (> 15.1 ng/bouchon) et à l’évidence extrêmement risqués cumulent 16.3 % des lots commerciaux analysés dans cet exemple précis.

Repartition-de-la-teneur-en-MDMP

Figure 5 – Répartition de la teneur en MDMP totale de différents lots (n = 43) de bouchons en liège naturels neufs offerts à l’achat à une même propriété durant une période de 60 mois (Limite de quantification= 2 ng/cork) et contrôlés avant leur utilisation.

Ces mêmes lots de bouchons ont été systématiquement contrôlés selon le protocole de dosage du TCA extractible dans une macération globale (50 bouchons/1000 ml de solution modèle) par HSSPME/GC/MS (21,22). Tous les lots en question ont été acceptés car contenant moins de 2.4 ng/l de TCA extractible, teneur représentant un risque statistique pour l’utilisateur de 3% jugé au plus acceptable (23). En fait, même si on ne connaît pas la proportion de bouchons individuellement contaminés par la MDMP au sein des lots, plus de trois quart de ces mêmes lots pourraient être considérés à risque (77,5%), soit une proportion bien plus importante que les pires statistiques de contamination par le TCA, contaminant jusque là considéré comme le plus critique pour les bouchons en liège !

Identification de MDMP dans des vins sans contact avec le liège mais avec du bois de chêne

Un même lot de vin rouge produit dans le Languedoc (France) à base de syrah et de grenache (30:70) a été divisé après achèvement normal des fermentations dans trois cuves en acier inoxydable de capacités différentes ; deux cuves sur les trois ont reçu des copeaux de chêne faiblement chauffés directement issu de l’emballage neuf du fabricant à la dose de 3 g/L durant quatre semaines, la troisième n’a subit aucun traitement et n’a reçu aucun produit. A l’issue de ce temps, l’œnologue procédant au contrôle organoleptique a décelé une altération de l’arôme et du goût dans les vins boisés ; au même moment le vin conservé sans bois était jugé parfaitement net. Le dosage des contaminants du vins par HSSPME/GC/MS (tableau 3) montre que les deux vins suspects sont massivement contaminés par de la MDMP avec un ratio atteignant cinq à sept fois le niveau du seuil de perception ; le vin de la cuve N°2 qui contient le plus de MDMP (15.3 ng/L +/- 0.40) contient également du TCA (1.6 ng/L +/- 0.03) à une valeur approchant celle du seuil de perception. A l’inverse, le même vin qui n’a pas reçu de copeaux ne contient pas de MDMP ni de TCA en concentrations détectables. Aucun résidu du lot de copeaux en cause n’étant disponible, nous n’avons pas pu effectuer de contrôle sur le bois précisément en question. Cependant, la situation étant extrêmement simple, ce résultat indique clairement que d’autres sources que les bouchons en liège puissent contaminer les vins en MDMP et notamment le bois de chêne.

ng/LTCATeCAPCATBAMDMP
Vin Témoin
Sans chips
nd5.211.8Tracesnd
Cuve 1 + chipstraces5.211.5Traces11.0
Cuve 2 + chips1.35.612.8Traces15.3

Tableau 4- Mise en évidence de la contamination d’un même vin conservé ou non avec des fragments de bois de chêne faiblement chauffés durant 3 semaines

Les conditions de conversation des déchets de bois employés pour la fabrication des copeaux industriels, entassés dans des fardeaux entreposés souvent à même le sol (24), pourraient expliquer leur contamination par la bactérie tellurique identifiée dans ce travail et la formation de MDMP avant leur chauffage.

Le chauffage du bois de chêne est une étape très courante de la fabrication des barriques ou des produits alternatifs à base de fragments de bois. Le traitement thermique du chêne se déroule entre 180 et 220°C et expose le bois à un chauffage radiatif ou bien convectif pendant une durée variant de 15 à 60 minutes environ (25). Dans ces conditions, nous montrons que la MDMP est très rapidement éliminée du bois (figure 6). Le traitement thermique du bois de chêne dans les conditions classiques de la tonnellerie ou de la production des solutions alternatives d’élevage devrait donc garantir l’élimination de cette source de pollution. Cependant, l’utilisation de bois de chêne peu ou pas chauffé est de plus en plus fréquente dans le cas des alternatives industrielles à la vinification et à l’élevage traditionnel en barrique. Dans ce cas, le bois faiblement chauffé et contaminé peut toujours contenir des quantités résiduelles de MDMP susceptibles d’affecter la qualité aromatique des vins. En effet, le chauffage à 105 °C durant 10 min ne permet de réduire que de l’ordre de 50 % la teneur en MDMP (12.6 ng/g +/- 2.4)  du bois de chêne contaminé originellement à 27.4 ng/g +/- 0.67.

Dégradation thermique de la MDMP

Figure 6 Dégradation thermique de la MDMP dans le bois de chêne chauffé à 220°C

En conclusion

Nous avons identifié dans ce travail une nouvelle espèce de protéobactéries du genre Rhizobium capable de former une quantité importante de MDMP, substance volatile et fortement odorante. Ce composé est détectable dans les bouchons en liège et dans des vins présentant un caractère olfactif « liégeux » et « poussiéreux » assez différent de l’odeur typiquement « moisie » du TCA. Compte tenu des différents travaux publiés antérieurement et des résultats présentés dans notre travail, il apparaît extrêmement probable que Rhizobium excellensis soit le microorganisme principalement responsable de la présence de cette molécule dans le liège. Néanmoins, d’autres observations indiquent que le liège n’est pas le seul vecteur de pollution des vins ; le bois de chêne peut être contaminé de la même manière. Compte tenu de la sensibilité de la MDMP à la température, à condition d’être suffisamment chauffé, le bois de chêne ne devrait pas pouvoir affecter significativement les vins. Il serait intéressant de contrôler un plus grand nombre d’échantillons de copeaux de bois de chêne afin de s’assurer de l’étendue de la présence de la MDMP dans ce type de matériau. Dans le cas des bouchons en liège, étant donné les caractéristiques physico-chimiques de cette molécule, il est probable que les techniques de décontamination effectives des bouchons utilisés pour réduire la teneur en TCA (traitement à la vapeur d’eau, combinaison vapeur-éthanol, extraction au CO2 supercritique) soient parfaitement efficaces pour éliminer également la MDMP. En revanche, compte tenu de la fréquence de la présence de la MDMP en quantité supérieure à 10 ng/bouchon dans le liège naturel, ce type d’obturateur semble posséder un potentiel de pollution des vins extrêmement préoccupant ce qui invite à contrôler de manière systématique sa présence avant utilisation à l’image de ce qui a été réalisé pour le TCA ces dernières années. A ce stade nous ne connaissons pas à quel moment s’effectue la contamination. L’origine du micro-organisme en cause laisse penser que la matière première (planche de liège, déchets de bois) stockée sur ou près du sol soit facilement contaminée. Des investigations supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer la présence de R. excellensis dans le liège et le bois de chêne et pour préciser les conditions d’apparition et d’accumulation de cette substance au cours des processus de fabrication et de stockage.

Désormais, compte tenu du risque potentiel d’altération pour les vins, les Laboratoires EXCELL vous propose d’ajouter le contrôle de la teneur en MDMP extractible dans son package de contrôle des bouchons neufs Check List Bouchon™ jusque-là principalement ciblé sur le potentiel en 2,4,6-trichloroanisole (TCA), en 2,4,6-tribromoanisole (TBA) et en Gaïacol extractibles du liège.

Voire L’analyse: 2- Methoxy -3,5- dimethyl pyrazine (2M35DP)         Version PDF EN: Origin-and-Incidence-of-MDMP