Analyses œnologiques & agroalimentaires

Brettanomyces : Mythes et Réalités

Brettanomyces: Mythes et Réalités

Pascal CHATONNET
Laboratoire EXCELL, Parc Innolin, 10 rue du golf, 33700 MERIGNAC, France, www.labexcell.com

Introduction

Brettanomyces est une levure connue depuis bien longtemps mais qui fait couler beaucoup d’encre depuis peu. Dernier sujet à la mode, les polémiques, mythes, solutions miracles sont désormais légions et contribuent à compliquer énormément un problème sérieux mais pour autant pas si complexe que certains coudraient le laisser croire… L’abondance d’informations de qualité variable sur ce sujet a plutôt nuit à la gestion et à la solution de la problématiques Brettanomyces dans les vins rouges. Cet article a pour objectif principal de faire le point sur les éléments clés susceptibles d’influencer significativement le développement de e microorganisme dans les vins et de dégager les outils pratiques et efficaces pour le contrôle de son développement.

Brettanomyces (forme sporulante Dekkera) est une levure initialement dans la bière par Claussen (1905)[1] puis dans des moûts en fermentation (Kufferath, 1921)[2] et finalement dans les vins par Custer (1940) et par Peynaud et Domercq (1956)[3]. Cette levure, qui appartient à la famille des Saccharomycetaceae (comme Saccharomyces) existe dans les vins principalement à travers l’espèce bruxellensis. Elle a été initialement décrite comme gênante en raison de sa capacité de re-fermentation des vins sucrés et de parasitage de la fermentation alcoolique par Saccharomyces sp. en formant le plus souvent de fortes quantité d’acide acétique. En fait, si ce type de problème existe bel et bien avec Brettanomyces, l’altération nettement plus fréquente et potentiellement la plus gênant est tout autre. En effet, cette levure est capable de décarboxyler les acides cinnamiques naturellement présents dans le raisin et le vin (acide p-coumarique, férulique et caféique) en vinyl-phénols et de les réduire ensuite en éthyl-phénols (4-éthyl-phénol principalement, 4-éthyl-guaiacol et accessoirement 4-éthyl-catéchol) qui s’accumulent. Ces molécules volatiles et odorantes sont très stables et communiquent aux vins un arôme à caractère « phénolé » très caractéristique que l’on a finalement qualifier de caractère « Brett ». La teneur en précurseurs d’éthyl-phénols n’est jamais un facteur limitant, tous les vins contiennent suffisamment d’acide p-coumarique (acide cinnamique le plus abondant) pour produire plusieurs milligrammes de 4-éthyl-phénol par litre de vin ! Après plusieurs années de polémiques inutiles, avec une capacité variable selon les souches, nous avons démontré[4] que seule Brettanomyces était capable de former dans les vins rouges les fortes quantités d’éthyl-phénols à l’origine du caractère « Brett ».

Le caractère « phénolé » ou « Brett » est relativement fréquent dans les vins rouges et affecte gravement la typicité aromatique variétale. C’est en cela et principalement (pour ne pas écrire uniquement) que Brettanomyces représente un problème sérieux en œnologie. En effet, si on laissait les vins évoluer naturellement avec Brettanomyces, qu’ils proviennent de Bordeaux, de Californie, d’Afrique du sud, du Merlot, de la Syrah ou du Tempranillo, tous finiraient pas présenter la même odeur ! Adieu la typologie géographique et l’identité variétale. Cela dit, tout est question de style et de goût. Certains producteurs ou amateurs apprécient ou recherchent ce type d’arôme. Peu m’importe. Mais qu’il ne soit plus invoqué le fameux « goût de terroir » ou la « typicité » du cru ou du cépage  pour expliquer l’odeur de « cuir » et « d’urine de cheval » qu’exhalent ces vins : il s’agit seulement de l’odeur de Brettanomyces.

Il n’existe pas de statistiques fiables quant à la fréquence du caractère « Brett » dans les vins mais seuls les vins rouges, nous verrons pourquoi plus bas, sont affectés par ce problème. L‘analyse d’un assez grand nombre de bouteilles[5] avait montré qu’environ 1/3 était potentiellement affecté par un défaut détectable à la dégustation (concentration en éthyl-phénols supérieure au seuil de perception dans un vin rouge, soit environ plus de 600 µg/l pour le mélange 4-éthyl-phénol/4-éthyl-guaiacol 1 :8 le plus fréquemment obervé). Il semblerait que la proportion soit aujourd’hui plus importante et que certaines régions soit plus affectées que d’autres… C’est pourquoi, il m’apparaît nécessaire de faire le point sur les mythes et les réalités qui entourent ce sujet afin d’offrir des solutions concrètes à ceux qui souhaitent vraiment le maîtriser.

Ecologie et Origine de Bretanomyces dans les vins

Cette question fondamentale a malheureusement fait l’objet d’un traitement polémique ces dernières années, ce qui a provoqué beaucoup d’incompréhension et de malentendus chez les praticiens. Tout d’abord, ce microorganisme a été présenté comme une « levure de contamination » ; ce terme laisse penser que sa présence est anormale ou exceptionnelle dans les vins ce qui est parfaitement abusif. En fait, cette levure est présente dans tous les environnements fermentaires ou presque, vin compris. Ensuite, différents travaux se sont évertués à démontrer que Brettanomyces provenait du raisin pour laisser penser que c’était le vignoble qui représentait la source principale de « contamination ». Bien évidemment, Brettanomyces n’est pas arrivée de la planète Mars dans un vaisseau spatial, ni même sur une météorite. Cependant, et toutes les études d’écologie le démontrent clairement, la fréquence de détection de cette levure sur le raisin est faible ou extrêmement faible (entre 0 à 3% des levures présentes) dans une très grande majorité de cas. Ce n’est que dans des configurations particulières, c’est-à-dire (i) un raisin plus ou moins altéré avec perte d’intégrité de la pellicule[6], ou bien (ii) dans le cas de parcelles sous le vent de sources de contamination massives[7] (rejets vinicoles épandus ou entassés) que l’on peut atteindre des populations conséquentes et susceptibles de poser un problème dans les caves. Ces situations rares doivent être identifiées précocement, la vendange sulfitée à un niveau plus important que la normale (7-8 g/hl) puis ensemencée avec un levain industriel pour ne poser aucun problème de vinification.

Mais le reste du temps, qu’elle est la source de contamination par Brettanomyces ? Et bien comme pour tous les microorganismes à l’origine de la transformation du raisin en vin : le matériel vinicole ! Brettanomyces reste peu présente, voire absente, de la microflore des processus fermentaires car les levures de fermentation et les bactéries lactiques se multiplient normalement plus rapidement. Cependant, de par les caractéristiques de son métabolisme et sa capacité d’adaptation, au premier accident fermentaire, elle peut coloniser rapidement le milieu et provoquer alors différentes altérations.

Pour expliquer le développement plus important noté parfois dans les barriques neuves par rapport aux usagées[8], le bois de chêne des barriques a été suspecté par certains « winemaker » de contaminer précocement les vins et de favoriser la multiplication de Brettanomyces. En fait, il n’en est rien ! L’explication est tout autre. Tout d’abord, Brettanomyces ne fait pas partie de la microflore normale du bois. Ensuite, les barriques neuves sont chauffées entre 150 et 230°C ce qui conduit à leur stérilisation si tant est qu’elles fussent contaminées… La quantité de sucres assimilables par Brettanomyces apportés par le bois neuf ne représente guère de chose face à ce qui existe naturellement dans les vins[9]. Les barriques usagées représentent toujours une source plus importante de contamination que les neuves car elles abritent potentiellement un inoculum et peuvent contenir des éthyl-phénols dans leur masse[10]. Néanmoins, en présence de vin initialement contaminé (c’est-à-dire dans la quasi-totalité des cas comme expliqué plus haut), il faut noter que la cinétique de disparition du dioxyde de soufre libre et actif, seul antiseptique utilisable au cours de l’élevage et actif dans une certaine limite contre Brettanomyces (voir plus bas), est plus rapide dans les barriques neuves que dans les barriques usagées (potentiel oxydant plus fort, évaporation plus élevée). Ainsi, paradoxalement, il s’ensuit que Brettanomyces puisse dans certains se développer plus rapidement dans les barriques neuves que dans les usagées et ce malgré un inoculum initial bien plus faible. Le niveau de dioxyde de soufre et l’ouillage doivent donc toujours être contrôlés plus fréquemment dans les barriques neuves, en particulier au début de l’élevage, pour éviter ce type de problème.

Quels sont les facteurs et les pratiques qui influencent le développement de Brettanomyces dans les vins ?

La macération pré fermentaire à froid est une pratique parfois utilisée pour la vinification des grands vins rouges afin de favoriser l’extraction de la couleur, ralentir celle des tannins et obtenir une fermentation alcoolique plus régulière. Cette pratique est réputée à risque, mais ce n’est pas exact si elle est conduite proprement. Tout d’abord, comme cité plus haut, Brettanomyces ne fait pas ou très peu partie de la microflore du raisin et encore moins si le sulfitage en vue de cette pratique a été réalisé correctement (> 5 g/hl). Ensuite, à moins que le moût ne soit contaminé très tôt (par le raisin altéré ou par la cave polluée), la population de Brettanomyces reste non décelable ou très minoritaire (5 à 10% au plus de la microflore levurienne) jusqu’à cinq jours de macération ce qui est déjà beaucoup ou excessif[11]. En revanche, si elle s’installe cette population perdurera ! La réalisation d’une macération initiale à froid sans risque impose donc d’utiliser un raisin sain, suffisamment sulfité, refroidit à une température convenable (< 10°C), non manipulé par des pompage (pour éviter sa contamination par le matériel vinaire), avec une durée inférieure ou égale à cinq jours au plus, pour éviter tous risques de contamination gênante.

Tout accident de déroulement des processus de fermentation représente une occasion de développement de Brettanomyces qui est un germe opportuniste par excellence. Les cas de contamination après un arrêt de fermentation ne sont pas rares, mais c’est surtout en cas de retard au sulfitage après une fermentation malolactique languissante que le risque est le plus élevé. Dans ce cas, l‘inoculation précoce par un levain de bactérie lactique est recommandé[12]. Malheureusement, dans la pratique, l’efficacité de cette technique reste encore un peu aléatoire. D’autres alternatives techniques sont envisageables (voir plus loin).

Les facteurs environnementaux influencent le métabolisme et la croissance de Brettanomyces/Dekkera sp.[13]. Sur le plan de l’équilibre de la composition du vin, la teneur en éthanol du vin affecte négativement la capacité de Brettanomyces à se développer mais il ne faut pas rêver, des vins à 15,5 % voL d’éthanol peuvent être altérés par des souches adaptées à ce type de milieu ! L’élévation du pH facilite grandement la multiplication de Brettanomyces. Le pH naturellement plus acide des vins blancs et rosés (pH < 3,5) les protège normalement de tout développement important de Brettanomyces/Dekkera. En dessous de 15°C, la croissance est fortement ralentie. L’augmentation de la température favorise la multiplication jusqu’à 32°C ; ceci explique que la fréquence des contaminations soit faible en hiver et augmente fortement en été. On aurait ensuite tendance à penser que l’abaissement de la température des chais d’élevage nettement en dessous de 15°C permettrait de lutter facilement contre Brettanomyces. Cependant, il faut se rappeler que c’est le couple éthanol/dioxyde de soufre moléculaire qui est le plus efficace pour limiter les populations en augmentant fortement la durée de la phase de latence12. Or, la teneur en dioxyde de soufre moléculaire dépend, pour un pH donné, de la quantité de SO2 libre et…de la température. Ainsi, réduire fortement la température des chais trouve donc rapidement une limite…En outre, l’abaissement de la température peut avoir d’autres inconvénient (assèchement en cas de conditionnement de l’air artificiel, consume et oxydation plus élevée, rapport bois/vin plus important, vitesse d’évolution du vin modifiée…). En conséquence, dans la pratique, une température comprise entre 15 et 17°C est idéale. Au-delà de 20°C, le risque de contamination augmente de manière exponentielle et la surveillance doit suivre en conséquence. En dessous, d’autres types de problèmes peuvent survenir.

La teneur en sucres résiduels du vin représente un autre facteur compositionnel sensible. Le risque de contamination gênante augmente de manière exponentielle avec la teneur en sucres résiduels ! Brettanomyces est une levure capable d’utiliser un grand nombre de sucres différents, y compris certains diholosides come le tréhalose que peut libérer Saccharomyces en fin de fermentation (notamment si les levures furent stressées) et au cours de l’élevage sur lies. Une quantité résiduelle de sucres (glucose, fructose, galactose, arabinose, saccharose, tréhalose) inférieure à 0,35 g/l peut être suffisante pour permettre le développement d’une population (1000 cellules/ml) susceptible de synthétiser une teneur en éthyl-phénols égale à leur seuil de perception (450 µg/l). Or cette quantité de sucres est disponible dans une très grande majorité de vins rouges à l’issue de la fermentation alcoolique et malolactique8. A partir de 1 g/l, le risque de contamination augmente dangereusement. La qualité et la vitesse d’achèvement des processus fermentaires, en limitant les ressources énergétiques à disposition, représente le premier facteur de maîtrise du risque Bettanomyces. Ensuite, en raison de la disponibilité accrue de certains substrats au sein des lies et de leur effet protecteur vis à vis du dioxyde de soufre, il est certain que l’élevage sur lies des vins rouges demeure une pratique pouvant favoriser indirectement le développement de Brettanomyces ; elle doit donc être réservée aux situations les plus saines et toujours limitée dans le temps. Un soutirage avant l’été est recommandé. Au-delà, la surveillance devra être particulièrement fine si le vin présente des facteurs compositionnels favorables (pH > 3,7 notamment).

Le bois de chêne n’est pas la cause de l’apparition plus fréquente du caractère « Brett » dans les vins élevés en barriques. Cependant, il est évident que la structure microporeuse du bois représente un abri idéal pour les microorganismes en général. Les barriques usagées représentent ainsi une source de contamination évidente ; Brettanomyces se développe aussi très bien comme nous l’avons déjà cité dans les barriques neuves mais également dans les cuves en matériau inerte. Bien évidemment, il est plus beaucoup plus facile de nettoyer et de désinfecter des cuves à surface lisse que des barriques ou des cuves en bois. Ce sont donc les techniques de maîtrise de l’hygiène des contenants en bois qui permettent de réduire le risque de développement de ce microorganisme au cours de l’élevage des vins (voir ci-après).

Brettanomyces peut également se développer au cours du vieillissement en bouteille de manière plus ou moins aléatoire (tout ou partie des bouteilles d’un même lot peut être affecté). Ce microorganisme est d’ailleurs systématiquement détecté parmi les levures des vins vieux en bouteille traduisant une remarquable capacité de maintien au cours du temps. Le plus souvent, les populations avant embouteillage sont extrêmement faibles. De par sa capacité de résistance au dioxyde de soufre, les concentrations employées à l’embouteillage ne permettent jamais de détruire totalement les levures résiduelles. Dès que la teneur en dioxyde de soufre libre a suffisamment diminué bouteille (par oxydation naturelle), Brettanomyces peut se multiplier de nouveau et produire suffisamment de phénols volatils pour causer un défaut malgré une population développée faible. Les conditions de contrôle et surtout d’élimination préventive des populations quiescentes (et difficiles à détecter) de Brettanomyces représentent donc un enjeu capital pour garantir le bon développement des vins en bouteille (voir ci-après) !

Moyens de lutte préventive contre Brettanomyces

Le contrôle de Brettanomyces se fait d’abord au vignoble

Cela peut paraître étrange, mais le facteur agronomique influence énormément le risque de contamination gênante. Non pas parce que la source d’inoculation se trouve sur le raisin, mais parce que l’équilibre de composition du raisin influence considérablement la sensibilité du vin au développement de Brettanomyces. En effet, le déséquilibre de l’alimentation minérale de la vigne et notamment l’excès de potassium conduit inévitablement à une élévation du pH des moûts puis des vins. Dans certains cas, si l’acidité n’est pas corrigée très tôt, il sera impossible d’utiliser le sulfitage pour inhiber le développement de Brettanomyces. A l’opposé, un défaut de fertilisation azotée par exemple, une concurrence excessive (enherbement mal contrôlé) ou un stress hydrique excessif (terroir à faible réserve en eau ou irrigation mal gérée), risque de produire des raisins difficiles à fermenter. Sans complémentation à la cave, ces raisins connaitront des fermentations lentes ou incomplètes, situations idéales pour favoriser le développement de Brettanomyces à court ou moyen terme. Il peut donc exister des « terroirs », ou plutôt des situations agronomiques, favorisant naturellement le développement de ce germe ; il est de la responsabilité de l’œnologue et surtout du viticulteur de corriger ou de prévenir ces situations de déséquilibres pour éviter des évolutions indésirables du vin a posteriori.

Utilisation du sulfitage

Le dioxyde de soufre est le seul antiseptique autorisé en œnologie mais Brettanomyes/Dekkera  est relativement résistant à cet antiseptique. La teneur en dioxyde moléculaire actif, le seul qui possède des propriétés antiseptiques, dépend principalement de la teneur en dioxyde de soufre libre et du pH (-0,2 unité de pH = + 50 % SO2 actif), plus accessoirement de la température (+1°C = +7% de SO2 actif) et de la teneur en éthanol du vin (+1 % vol. = +5% SO2 actif). Une concentration en dioxyde de soufre moléculaire actif de 0,5 mg/l est juste suffisante pour inhiber la multiplication sans l’empêcher complètement. A partir de 0,7-0,8 mg/l, la teneur devient létale si la température est suffisamment élevée. Ainsi, si une teneur de 25 mg/l est suffisante pour contrôler le développement de Brettanomyces à pH 3,60, il faudra au moins 35 mg/l à pH 3,75 et près de 60 mg/l à partir de pH 3,90…On voit donc bien que l’utilisation du sulfitage est fortement limitée par l’acidité réelle du vin ; ce paramètre représente donc un élément clé de la « résistance naturelle » du vin vis-à-vis des contaminations par ce type de germe. Le sulfitage des vins élevé en barrique doit être encore plus soigneux car la stabilité du dioxyde de de soufre dans ces conditions est nettement plus aléatoire. L’élevage bonde de côté de manière prolongée, l’absence d’ouillage au prétexte que l’on utilise des bondes en silicone plus étanche, la réduction des doses de dioxyde de soufre ou l’absence de soutirage régulier pour limiter le travail de la cave sont autant de facteurs qui ont provoqué l’explosion des contaminations dans les caves ses dernières années. Enfin, il faut toujours considérer le sulfitage du vin comme un outil de lutte préventive et non pas curatif.

Le méchage des barriques après leur nettoyage par combustion de soufre est une pratique souvent abandonnée en raison de ses désagréments et même récemment mise en cause au plan légal. Pour autant, l’action du dioxyde de soufre gazeux est particulièrement intéressante pour assurer la désinfection de la surface et des premiers millimètres des douelles de barriques9. La pratique du méchage a démontré son efficacité dans la prévention des contaminations par Brettanomyces lorsqu’aucun autre moyen de désinfection (vapeur en particulier) n’est disponible dans la cave. Son remplacement par des techniques alternatives comme le rinçage à l’eau ozonée ne peut produire exactement le même résultat en raison de l’action essentiellement superficielle du principe actif. Parmi les traitements physiques alternatifs, aucune solution ne possède la simplicité, la productivité, l’efficacité et le coût du méchage basique…Il est donc à souhaiter que cette pratique puisse perdurer encore pour un temps illimité.

Hygiène et désinfection du matériel vinaire

Le matériel de cave et les contenants vinaires représentent le principale réservoir de Brettanomyces dans la cave. C’est à partir de ses réservoirs que la contamination, limitée à un lot de vin au départ peut s’étendre au gré des mouvements de vins et de l’utilisation du matériel, à l’ensemble du volume. La désinfection du matériel est donc un élément crucial du contrôle de ces germes, mais toute désinfection ne sera efficace qu’après un nettoyage suffisant. La situation est plus compliquée avec le bois qui possède une surface développée beaucoup plus importante que l’acier inoxydable ou la résine époxy. En outre, ce matériau est délicat et les procédures de nettoyage et de désinfection ne doivent pas le dégrader. Une publication spécifique a été consacrée par ailleurs à ce sujet et je renvoie les lecteurs à sa consultation pour obtenir toutes les informations nécessaires[14].

Les moyens de lutte curative

Les traitements physiques

Le traitement thermique du vin, encore appelé flash-pasteurisation, est une technique efficace pour la destruction de tous les types de microorganismes. Les conditions de traitement doivent être adaptées aux caractéristiques de résistance de chacun. Les caractéristiques de destruction thermique de Brettanomyces sont connues et dépendent des conditions du milieu[15]. Le temps de réduction décimal (DT) est de 0,3 à 0,4 min à 55° quelque soit l’état physiologique de la cellule ; le facteur Z, qui permet de réduire le DT par 10, est de 5°C. Ces paramètres peuvent aussi être appliqués à la désinfection thermique des barriques. Une fois traité, le vin peut se contaminer à nouveau facilement. En outre, l’élévation de la température à haute température pendant quelques secondes suivit de son refroidissement doit être réalisé parfaitement à l’abri de l’air pour ne causer aucune oxydation préjudiciable. Ce procédé est intéressant pour bloquer un développement fulgurant sur des vins jeunes, éventuellement sucrés et difficiles à filtrer.

La filtration est une technique classique d’élimination des micro-organismes. La qualité de son résultat dépend de la porosité du media filtrant qui doit être adapté aux microorganismes ciblés. Dans le cas de Brettanomyces, a fortiori si on s’adresse à des vins en fin d’élevage, les cellules sont de petite taille et imposent une filtration avec un seuil de coupure inférieur à 1 µm (et idéalement inférieur à 0,65 µm) si on veut garantir une élimination totale. Il est ridicule de penser que la filtration puisse affecter négativement la qualité du vin si cette dernière est bien conduite et bien préparée. Si la filtration à ce niveau de porosité affectait sérieusement la qualité c’est que cette qualité reposait, compte tenu de leur taille, sur des éléments bien peu stables… En fait, c’est le colmatage qui est préjudiciable à la qualité, c’est à dire la filtration en surpression sur un medium peu poreux, qui lui peut éliminer des éléments positifs pour la qualité organoleptique. Pour éviter d’affecter négativement la qualité des vins lors de leur filtration, il est souvent indispensable de procéder par étages de filtration successifs (3 puis 1µm), de préfiltrer, ou de prétraiter enzymatiquement pour éviter de colmater le medium stérilisant et de décharner les vins[16]. La prise en compte unique de la turbidité ne renseigne pas vraiment sur la filtrabilité d’un vin. La détermination de l’indice de colmatage[17] peut aider à adapter la stratégie de préparation du vin[18]. Ainsi, la filtration est particulièrement recommandée avant la mise en bouteille lorsque le vin présente un certain profil de risque ou qu’une population de Brettanomyces a été détectée lors du contrôle avant tirage (voir ci-après).

D’autres traitements physiques ont été envisagés et testés. La stérilisation UV (UV-A germicide) n’est pas adaptée au traitement des vins rouges en raison de la forte absorption du rayonnement ultra-violet par les polyphénols en présence. Le traitement haute-pression (destruction des cellules au-delà de   bars) est certainement efficace mais extrêmement coûteux sans offrir de débits suffisants (traitement discontinu). Le traitement par électroporation (perforation des membranes cellulaires sous l’effet d’une différence de potentiel appliquée dans une cellule de traitement en continu) possède également une certaine efficacité[19], mais là encore le peu d’équipement disponible et les débits de traitement limitent considérablement l’intérêt pratique de cette technologie pour le moment.

Utilisation du Chitosane

Le chitosane est un polymère naturel de N-acétylglucosamine, dérivé de la chitine déacétylé chimiquement ou enzymatiquement. La chitine se rencontre notamment dans les carapaces des crustacés, des céphalopodes et dans la paroi des champignons filamenteux. Le traitement de la chitine produit le chitosane. Ce polymère doit posséder un degré de déacétylation bien particulier pour être efficace vis-à-vis de Brettanomyces/Dekkera ; le degré de déacétylation influence également la solubilité et la viscosité de la suspension du chitosane. Actuellement, seul le chitosane d’origine fongique, qui peut s’accompagner de plus ou moins de b-glucane, est curieusement autorisé en œnologie…La source principale de chitosane dans le monde, à savoir la source animale, beaucoup plus abondante et moins couteuse, ne fait pas pour le moment l’objet d’autorisation et se trouve donc interdit. Il est probable que le potentiel allergénique des crustacés face à celui des champignons soit la motivation de sa « non autorisation ». Cependant, le chitosane de crustacés/céphalopodes est par ailleurs largement employé dans l’industrie agro-alimentaire et la pharmacie sans aucune restriction…Il est donc souhaitable que la source animale soit rapidement autorisée pour permettre d’abaisser le coût d’utilisation aujourd’hui prohibitif. Le mode d’action exact du chitosane demeure inconnu. On sait que ce polymère cationique se lie aux parois des levures Brettanomyces/Dekkera de manière relativement spécifique et provoque une altération de l’intégrité de la membrane ; Saccharomyces sp. ou Enococcus sp. présents simultanément ne sont pas affectés[20] ce qui permet d’envisager l’utilisation de ce produit en cours de vinification, en cas d’arrêt de fermentation ou de retard à l’achèvement de la malolactique par exemple. Au cours de l’élevage, le chitosane à la dose de 4 à 6 g/hl permet de détruire en quelques jours des populations importantes de Brettanomyces ; les cellules détruites ne peuvent plus former d’éthyl-phénols. Cependant, compte tenu du caractère insoluble du chitosane actif vis-à-vis de Brettanomyces son efficacité est souvent plus efficace et la durée de protection plus longue dans les grands contenants que dans les petits. Sa sédimentation plus rapidement dans les barriques pourrait nécessiter une remise en suspension régulière (bâtonnage) pour maintenir son activité et sa tendance à provoquer une certaine désacidification du vin, peuvent compliquer son utilisation.

Utilisation du diméthyl-dicarbonate (DMDC)

A part le dioxyde de soufre, le seul antiseptique chimique utilisable dans le vin est le diméthyl-dicarbonate. Ce produit (Velcorin™) s’hydrolyse rapidement dans le vin et ne présente donc un intérêt que pour la « stérilisation à froid » en remplaçant la filtration ou le traitement thermique avant l’embouteillage. L’un des produits d’hydrolyse, le méthanol, limite la dose maximum utilisable pour ne pas dépasser la concentration maximale autorisée dans les vins rouges (…. mg/l), cette teneur limite d’ailleurs a été spécialement élevée pour que ce produit puisse être valablement utilisé….Il faut utiliser au minimum 200 mg/l pour garantir une bonne efficacité vis-à-vis de Brettanomyces/Dekkera. Il faut aussi rappeler que, pour le moment, l’utilisation du DMDC est limitée aux vins contenant plus de 5 g/l de sucres résiduels…et que ce produit fait l’objet d’une distribution monopolisée qui maintient un coût d’utilisation exagérément élevé au regard du prix de revient du produit par lui-même. Son utilisation est limitée au moment de l’embouteillage mais cette technique donne d’excellents résultats à long terme et supprime la nécessité de filtration stérile des vins les plus délicats à gérer.

Utilisation d’antibiotiques

L’utilisation de principes antibiotiques est interdite en œnologie. La Natamycine ou Pimaricine, toxine anti-levures produite par naturellement certaines bactéries du genre Streptomyces, est pourtant un adjuvant (E235) utilisé largement dans l’industrie agroalimentaire (il est vrai seulement pour le traitement externe de certains fromages et de la charcuterie sèche…). Malgré son efficacité, son utilisation est totalement proscrite dans le vin. Une crise importante est intervenue récemment en Amérique du sud (en particulier en Argentine) en raison de l’utilisation incontrôlée de ce produit. L’utilisation de toxines Killer produites par des levures appartenant plus ou moins à la microflore du vin (Kluyveromyces wickerhamii, Pichia anomala)[21]. D’autres peptides (dérivés de lactoferrine bovine) ont également montré aussi une toxicité vis-à-vis de ces mêmes microorganismes  mais avec des efficacités variables selon les souches[22]. Ces solutions représentent des pistes de lutte biologique intéressantes peut être mais seulement pour le futur.

Moyens de diagnostic et de contrôle du développement de Brettanomyces/Dekkera dans les vins

L’observation microscopique est parfois évoquée pour « identifier » la présence de Brettanomyces. Il est donc utile de préciser qu’il est totalement illusoire de pouvoir distinguer et a fortiori identifier ce genre de levures dans un vin car aucun des types morphologiques caractéristiques ne se maintient clairement face dans les conditions physico-chimiques du vin ! Ceux qui distinguent des Brettanomyces par la seule observation sont donc victimes la plupart du temps d’hallucinations…

Le Dosage des éthyl-phénols permet de diagnostiquer clairement la présence actuelle ou passée de Brettanomyces/Dekkera dans un vin. Son suivi régulier (mensuel en période estivale) au cours de l’élevage permet, de la même manière que l’on suit l’évolution des bactéries acétiques par le dosage de l’acidité volatile, de suivre le développement des populations de levures bien avant qu’elles n’atteignent un seuil critique. Cette technique que nous avons initiée pour la surveillance de l’élevage en barriques il y a déjà plusieurs années (Suivi Brett®), est simple (prélèvement d’un échantillon de plusieurs barriques représentatives) et rapide (24h) ; elle permet de réagir facilement dans la cave (soutirage, sulfitage, filtration ou action plus énergique) selon l’intensité du développement décelé d’après la variation de teneurs en phénols volatils. A ce stade, le contrôle microbiologique n’a que peu d’intérêt. Le contrôle microbiologique en cours d’élevage est nettement plus compliqué (prélèvement stérile), lent à produire (5 à 8 jours) et difficile à interpréter (voir ci-après) s’il procède par culture. En effet, en raison (i) des variations existant d’une souche à l’autre en matière d’ajustement des cinétiques de croissance à la production de phénols et (ii) des différences de capacité de production de phénols d’une souche à l’autre[23], il n’existe pas de relation claire entre population viable et teneur en phénols volatils. En conséquence, au cours de l’élevage, peu importe finalement de connaitre la population de Brettanomyces/Dekkera, mieux vaut connaitre la teneur et l’évolution de la teneur en phénols pour prédire les conséquences pratiques au niveau de la qualité du vin. Cette technique devrait être généralisée dans les caves élevant un grand nombre de barriques de vins de haute qualité pour prévenir toute évolution indésirable.

Le contrôle et la détection des populations de micro-organismes

La connaissance des populations de Bretanomyces/Dekkera est en revanche indispensable avant l’embouteillage pour estimer le risque de déviation future en bouteille ! Il est incompréhensible que des vins puissent être aujourd’hui conditionnés sans avoir été contrôlés au préalable. L’estimation des populations peut être réalisée à l‘aide de différentes techniques, mais pour tous le prélèvement de l’échantillon doit être réalisé sur un vin homogénéisé car Brettanomyces n’est pas un germe mobile et a donc tendance à sédimenter au fond des récipients.

La première méthode procède par le dénombrement des populations viables obtenues après culture sur un milieu spécifique. Cette méthodologie présente trois limitations principales. La première est relative à la soit disant spécificité des milieux de culture utilisé. Il s’avère que la grande majorité des laboratoires et des milieux de culture aujourd’hui commercialisés ne sont pas des milieux strictement spécifiques de Brettanomyces/Dekkera . Ils sont (aux mieux) plutôt spécifiques des levures non Saccharomycodes (utilisation du cycloheximide comme agent sélectif). Le vin (en particulier ceux élevés en barriques) peut abriter des levures se développant sur ces milieux (Pichia sp., Hansenula sp., Zygosaccharomycodes, Hanseniaspora sp.) mais qui ne présentent pour autant aucun risque de produire un caractère « phénolé ». L’utilisation de ces milieux a donc tendance à surestimer parfois fortement les populations présentes (vins prélevés en barriques). Ensuite, le dénombrement des cellules viables dans le vin nécessite une durée de culture variant entre 5 et 8 jours, un temps suffisamment long pour développer une altération si le vin est notablement contaminé… Enfin, le dénombrement par culture ne prend pas en compte les « germes viables mais non cultivables » (VNC) qui correspondent à des cellules dans un état physiologique stressé, incapables de se multiplier à court terme, ce qui les laisse passer pour morte alors qu’elles sont en fait capables de se multiplier à moyen ou long terme. Les VNC représentent malheureusement la grande majorité (70 à 90%) des micro-organismes présents dans les vins bien élevés et correctement préparés à la mise en bouteille (collage, filtration et niveaux de dioxyde de soufre actif ajustés pour réduire le plus possible la présence microbiologique en général). Il s’ensuit donc toujours une sous-évaluation du risque lorsque la microbiologie traditionnelle est employée. Si elle est employée, elle doit au minimum utiliser un milieu performant et vraiment sélectif comme celui que nous avons développé et pouvons mettre à disposition (Excell Brett Selective Medium©).

Le dénombrement à l’aide des techniques de biologie moléculaire permet d’accéder de manière très spécifique et rapide aux germes appartenant au genre Brettanomyces/Dekkera. La technique utilisant la PCR (Polylmerase Chain Reaction) quantitative en temps réel (RT-PCR) permet de mesurer précisément et de manière sensible (10 cellules/ml) le nombre de cellules présentes d’après le nombre de copie d’une fraction spécifiquement amplifiée du génome de ces levures[24]. La détection simultanée à l’amplification permet d’obtenir des résultats quasiment en temps réel après avoir extrait et purifié l’ADN contenu dans les cellules ; le laboratoire obtient des résultats dans la journée ou la demi-journée ce qui es extrêmement utile. L’analyse de l’ADN contenu dans des cellules intègres permet en théorie de mesurer les cellules viables, qu’elles soient dans un état quiescent ou non. Dans la pratique, cette technologie a tendance à surestimer légèrement les populations réelles car il s’écoule quelques jours à quelques semaines entre la mort, puis la perte d’intégrité d’une cellule et la disparition totale de l’ADN amplifiable. Avec la RT-PCR classique, on mesure donc plutôt les cellules totales. Une modification du protocole (EMA-RTPCR) avant amplification (intercalation de bromure monoazide d’éthidium) permet de déterminer désormais spécifiquement les « vraies cellules viables »[25],[26]. Cette technique (EXCELL Gen® Brett) est particulièrement utile en contrôle qualité lors de la préparation des vins à la mise en bouteille pour déterminer l’intérêt d’une stabilisation microbiologique et préciser, si nécessaire, le medium filtrant idéal. Elle permet aussi de contrôler en ligne l’efficacité du procédé avant la fin du chantier et d’expédier les vins en vrai connaissance de cause. Avec d’autres types de sondes nucléiques, cette même technique permet aussi de mesurer (sur un même échantillon et dans le même délai) les levures totales, d’autres types de levures de contamination (Zygosaccharomyces bailli par exemple), les principales bactéries lactiques de contamination (Lactobacillus sp. et Pediococcus sp.) ou les bactéries acétiques du vin (Acetobacter et Gluconobacter sp.).

La cytométrie de flux est une technique de comptage des cellules des microorganismes après leur coloration avec un agent fluorescent détecté par un compteur de particules après excitation et mesure de la fluorescence. Cette technique est séduisante par sa simplicité et sa rapidité. Néanmoins, la technique basique généralement proposée fait appel à une coloration qui n’est pas un réactif spécifique de Brettanomyces/Dekkera ; les promoteurs de cette technique distinguent ce type de germe des autres levures par un critère de taille en supposant que les cellules les plus petites (3 µm) correspondent à Brettanomyces/Dekkera…Or, on sait que le critère de forme ou de taille n’est pas extrêmement fiable dans les conditions physico-chimiques du vin. Les germes VNC peuvent posséder des tailles relativement réduites mais également une réactivité au colorant faible ou pour le moins variable. Il s’ensuit que le taux de détection dans le vin par cytométrie de flux des germes supposés être des Brettanomyces s’avère assez élevé (>200 cellules/ml) et la spécificité de la méthode très relative.

Le développement de réactifs colorants différents utilisant la fluorescence in situ après hybridation avec l’ADN (FISH), ou mieux le couplage FISH-Acide nucléique peptique (PNA-FISH) plus sensible et plus robuste, permet des contrôles par épifluorescence ou par cytométrie de flux (FISH-FCM) réellement spécifiques et plus sensibles (100 cellules/ml)[27]. On pourra également valablement distinguer les cellules mortes des vivantes en couplant la coloration au PNA-FISH à une coloration spécifique des cellules vivantes et mortes avec la technologie Backlight™  dans une prochaine version de cette technique que nous étudions.

A côté des différentes méthodes listées ci-dessus, il existe d’autres solutions qui relèvent plus du test de dépistage que d’un réel diagnostic voire même du gadget. Le test SNIF BRETT® consiste à faire une culture liquide de vin pour déceler la présence de Brettanomyces par la détection olfactive des éthyl-phénols après plusieurs jours d’incubation ; l’intensité relative du risque serait inversement proportionnelle à la vitesse d’apparition de l’odeur…Cependant, la détection de l’odeur des phénols volatils est intimement à la sensibilité de chacun et certaines personnes sont vraiment peu sensibles à cet arôme. Ensuite, comme nous l’avons déjà cité plus haut, il n’existe pas de relation stricte entre la production de phénols volatils et la population de levures de contamination. Enfin le délai de réponse du test pour être évidente est assez long. En conclusion, seule un test franchement et rapidement positif permet de tirer une conclusion, mais alors il est déjà trop tard…Un test négatif ne permet pas de conclure avec sureté, mais sa répétition périodique à courte échéance permet néanmoins d’assurer un certain suivi.

La détection de Brettanomyces par une réaction immunologique utilisant des anticorps couplés à une réaction enzymatique colorée (ELISA) a fait l’objet de différentes tentatives. La seule formule commerciale encore apparemment disponible (Z-Brett™ de Z-Enology) utilise une bande de fluorure de polyvinylidène imprégnée de réactifs immobilisés sur laquelle on dépose un volume de centrifugat du vin à tester[28]. La réponse se traduit après réaction complète par une coloration plus ou moins foncée que l’on peut relier qualitativement et approximativement à une référence. Le test est simple à mettre en œuvre, assez rapide. La sensibilité annoncée est ambitieuse (10 ou 100 cellules/ml) mais elle nécessite pour être atteinte une concentration importante de l’échantillon par centrifugation, ce qu’il n’est pas aisé de réaliser avec une reproductibilité honnête. En outre, les anticorps développés sont poly clonaux et donc pas vraiment spécifiques de Brettanomyces/Dekkera : Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Candida sp. qui sont encore une fois classiques dans les vins élevés en barriques réagissent et perturbent le résultat en exagèrant la réponse. Ce test ressemble donc plus à une méthode de détection binaire positif/négatif pour des populations en fait assez élevées (> 1000 cellules/ml).

Conclusions

La problématique Brettanomyces/Dekkera est de plus en plus importante dans le monde entier. Pourtant, les éléments fondamentaux qui influencent son développement dans les vins sont connus depuis assez longtemps. Pour autant, peut être en raison de certains débats inutiles ces derniers temps, la proportion de vins rouges altérés par un caractère « Brett » plus ou moins prononcé est nettement croissante ! La gestion de Brettanomyces ne nécessite pas normalement d’interventions ou de moyens curatifs systématiques et compliqués. Il n’est pas question et surtout pas nécessaire de vouloir bannir totalement Brettanomyces de la microflore des caves, mais bien d’apprendre à gérer les populations à un niveau non nuisible du début de la vinification jusqu’au vin finalement embouteillé. Pour cela, il convient de respecter certains principes et règles de bon sens qui sont désormais étayés scientifiquement La maîtrise de cette question commence bien au vignoble ; c’est souvent un aspect sous-estimé, mal compris ou pire ignoré. Elle continue ensuite en réalisant des fermentations de bonne qualité. Au milieu de tout le fatras proposé aux œnologues et aux vignerons pour suivre, analyser ou diagnostiquer la présence de Brettanomyces dans les vins aux différents stades de son élaboration, il faut trier et aller à l’essentiel. Une bonne prophylaxie en général et un suivi précis à chaque étape clés en utilisant des méthodes réellement appropriées, permettra de maîtriser parfaitement un micro-organisme extrêmement bien adapté au vin et génialement opportuniste. A la moindre erreur ou relâchement, Brettanomyces/Dekkera sera toujours là pour combler le vide dont la nature a horreur !

PCH
23/4/2012

Voir nos analyses: Brettanomyces                          Références bibliographiques